Βιοαποικοδομηση πετρελαιοειδων και εξυγιανση λασπησ διυλιστηριων

Ελευθερία Κατσίβελα και Νίκος Καλογεράκης

Εργαστήριο Βιοχημικής Μηχανικής & Περιβαλλοντικής Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Μηχανικών Περιβάλλοντος, Πολυτεχνείο Κρητης, Πολυτεχνειούπολη, 73100 Χανιά, (Email: ekatsive@mred.tuc.gr).

Αυτόχθονοι μικροοργανισμοί ικανοί να αποικοδομούν υδρογονάνθρακες πετρελαίου εμπλουτίστηκαν και απομονώθηκαν από δείγματα εδάφους, που προέρχονταν από τις περιοχές διαχείρισης λάσπης διυλιστηρίων (landfarming areas) των διυλιστήριων Κορίνθου της Motor Oil Hellas, με σκοπό την μελέτη και βελτιστοποίηση του ρυθμού βιοαποικοδόμησης των πετρελαιοειδών αποβλήτων. Στελέχη βακτηρίων και μυκήτων αναλύθηκαν σε πειράματα αποικοδόμησης με αλειφατικά και αρωματικά κλάσματα πετρελαίου. Κλάσματα υδρογονανθράκων πετρελαίου, που εκχυλίστηκαν από λάσπη διυλιστηρίων, καθώς και πετρελαΐκοί υδρογονάνθρακες, διαθέσιμοι στο εμπόριο, χρησιμοποιήθηκαν σαν μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας για την ανάπτυξη τους. Μεικτές βακτηριακές καλλιέργειες και καλλιέγειες μυκήτων παρατηρήθηκαν ότι ήταν ικανές να αποικοδομούν πετρελαιοειδή από λάσπη διυλιστηρίων. Δύο από τα καλύτερα αναπτυσ-σόμενα βακτηριακά στελέχη ταυτοποιήθηκαν με την μέθοδο του προσδιορι-σμού της αλληλουχίας του 16S rDNA και ανήκουν στα γένη Enterobacter και Ochrobactrum. Δύο άλλα στελέχη μυκήτων με αποικοδομητικές ικανότητες, που απομονώθηκαν, ταυτοποιήθηκαν με μεθόδους, που βασίζονταν στα φαινοτυπικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά καθώς και στις ιδιότητες αύξησης τους, και ανήκουν στα γένη Aspergillus και Pseudallescheria. Τα απομονωμένα στελέχη έδειξαν ένα ευρύ φάσμα μεταβολικών δραστηριοτήτων για διαφορετικά είδη υδρογονανθράκων πετρελαίου, όπως μονοκυκλικοί, πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες και αλκάνια. Συγκεκριμένα τα απομονωμένα βακτήρια Enterobacter cloacae EK3.1 και Ochrobactrum tritici EK6 έχουν την πρωτοφανή ικανότητα να αποικοδομούν δύο από τις πιο δύσκολα μεταβολιζόμενες κατηγορίες πετρελαιοειδών υδρογονανθράκων, τα διακλαδιζόμενα αλκάνια και τους πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες με 3 δακτύλιους. Δεδομένα κινητικής αποικοδόμησης σε καθαρές και μεικτές καλλιέργειες μικρο-οργανισμών θα παρουσιαστούν στην παρούσα εργασία.

ΑΝΑΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣΗ ΤΟΥ

S-ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΥ ΑΠΟ ΑΡΑΒΟΣΙΤΟ ΚΑΙ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ

ΤΗΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΓΙΑ ΤΟ ΞΕΝΟΒΙΟΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ

N.E. Λάμπρου, Γ. Κοτζιά, Π. Νάσης & Ι.Δ. Κλώνης

Εργαστήριο Ενζυμικής Τεχνολογίας, Τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιερά οδός 75, 11855-Αθήνα

Οι S-μεταφοράσες του γλουταθείου (GSTs, EC 2.5.1.18) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια διμερών πρωτεϊνών που καταλύουν την αντίδραση συμπύκνωσης του γλουταθείου (GSH) με μεγάλη ποικιλία υδρόφοβων υποστρωμάτων που διαθέτουν δραστικό ηλεκτρονιόφιλο κέντρο. Τα ένζυμα αυτά συμμετέχουν στο μηχανισμό αποτοξίνωσης του κυττάρου από μικροβιακές τοξίνες, ξενοβιοτικές και ενδογενείς ηλεκτρονιόφιλες τοξικές ουσίες.

Κινητική ανάλυση της GST I από αραβόσιτο έδειξε ότι το ένζυμο ακολουθεί ταχείας ισορροπίας αλληλοδιάδοχο Βi-Βi μηχανισμό δέσμευσης των υποστρωμάτων του. Το καθοριστικό στάδιο της ταχύτητας της αντίδρασης είναι η απελευθέρωση των προϊόντων.

Επιλέχτηκαν εννέα αμινοξέα (Ser-11, Trp-12, Phe-35, His-40, Lys-41, Gln-53, Asn-49, Ser-69, and Ile-118) που συμμετέχουν στη δέσμευση των υποστρωμάτων και εκτιμήθηκε η συνεισφορά τους στον καταλυτικό μηχανισμό εφαρμόζοντας τεχνικές κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αμινοξέα αυτά: i) ρυθμίζουν την K_m του ενζύμου για τη GSH, ii) επηρεάζουν τον ιονισμό της σουλφυδρυλομάδας του GSH, και κατά συνέπεια τη δραστικότητα του iii) συμμετέχουν στη ρύθμιση της καταλυτικής σταθεράς kcat επηρεάζοντας το καθοριστικό στάδιο της ταχύτητας της αντίδρασης iv) καθορίζουν την εκλεκτικότητα του ενζύμου έναντι του ξενοβιοτικού υποστρώματος, v) επηρεάζουν την δομική ακεραιότητα και την κινητικότητα του 310-ελικοειδούς τμήματος της α-έλικας Η2.

Τα αποτελέσματα της εργασίας αποτέλεσαν τη βάση του ορθολογιστικού ανασχεδιασμού της εκλεκτικότητας του ενζύμου έναντι του ξενοβιοτικού υποστρώματος.

ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗ IN VITRO ΤΟΥ ΚΡΗΤΙΚΟΥ ΛΑΔΑΝΟΥ (Cistus creticus spp. creticus)

Μαδέσης Παναγιώτης, Κωνσταντινίδου Ελπινίκη, Νιάνιου Ειρήνη και Τσαυτάρης Αθανάσιος

Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης των Φυτών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

Το φυτικό είδος Cistus creticus spp. creticus είναι ενδημικό του ελληνικού χώρου. Η εμπορική του αξιοποίηση στηρίζεται στις φαρμακευτικές ιδιότητες της ρητίνης «λάδανο». Η ρητίνη αυτή εκκρίνεται από τις αδενώδεις τρίχες των φύλλων και παρουσιάζει ισχυρή αντιμικροβιακή δράση (Demetzos και συνεργάτες, 1997) και κυρίως αντιλευχαιμική δράση (Dimas και συνεργάτες, 1998), η οποία μπορεί να συγκριθεί με καθιερωμένα φάρμακα των κατηγοριών αυτών, όπως είναι η αμπικιλλίνη και η καμπτοθεκίνη.

Για την εγκατάσταση της καλλιέργειας in-vitro χρησιμοποιήθηκαν σπόροι και βλαστικές κορυφές που προήλθαν από μητρικά φυτά που καλλιερ-γήθηκαν στον αγρό. Οι βλαστικές κορυφές έδωσαν μεγαλύτερο αριθμό φυτικού υλικού  σε μικρότερο χρονικό διάστημα. Ο μικροπολλαπλασιασμός των βλαστικών κορυφών σε βασικό υπόστρωμα MS χωρίς την προσθήκη ρυθμιστών αύξησης έδωσε το μεγαλύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού (6 φυτά ανά βλαστική κορυφή). Στα πειράματα της αναγέννησης, τα καλύτερα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν χρησιμοποιήθηκε ως έκφυτο το κατώτερο τμήμα των τεσσάρων φύλλων της κορυφής. Το υπόστρωμα MS με τον συνδυασμό ρυθμιστών αύξησης  0.1 mg/L NAA και 0.1 mg/L TDZ, μας έδωσε το μεγαλύτερο ποσοστό αναγέννησης 33.33%.

IN VITRO ΜΙΚΡΟΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗ ΤΗΣ ΒΕΡΙΚΟΚΙΑΣ Prunus Armeniaca ΠΟΙΚΙΛΙΑΣ «ΜΠΕΜΠΕΚΟΥ»

Παπαδόπουλος Αιμίλιος, Νιάνιου Ειρήνη και Τσαυτάρης Αθανάσιος, Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης Φυτών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Τ.Θ. 261 Τ.Κ. 54 006 Θεσσαλονίκη.

Η ιστοκαλλιέργεια αποτελεί ένα από τα δυναμικότερα εργαλεία για τον πολλαπλασιασμό των φυτών. Αποκτά ακόμη μεγαλύτερη σημασία  στην περίπτωση φυτών στα οποία ο εγγενής πολλαπλασιασμός δεν είναι επιθυμητός. Στα δενδροκομικά είδη, ο in vitro μικροπολλαπλασιασμός και αναγέννηση αν και συγκεντρώνουν πολλά πλεονεκτήματα ως ερευνητικές μέθοδοι, δεν έχουν εξελιχθεί όσο θα έπρεπε κυρίως λόγω των δυσκολιών που παρουσιάζουν. Στο εργαστήριο μας δημιουργήθηκε ένα πρωτόκολλο μικροπολλαπλασιασμού και αναγέννησης της Βερικοκιάς Prunus Armeniaca, ποικιλίας «Μπεμπέκου» με καλά αποτελέσματα.

Συγκεκριμένα, εξελίχθηκαν θρεπτικά υποστρώματα στα οποία η  ποικιλία «Μπεμπέκου» αντέδρασε άριστα, καθορίστηκαν συνδυασμοί ρυθμιστών αύξησης που έδωσαν ρυθμό πολλαπλασιασμού έως και 1:6,3 ανά 30 ημέρες και επιμήκυνση έως και 4 εκατοστά και τέλος επιτεύχθηκε ριζοβολία σε ποσοστό 20 έως 60%. Από τα διάφορα τμήματα των εκφύτων που ελέγχθηκαν ως προς τις αναγεννητικές τους ικανότητες, ο κάλος της βάσης και ο μίσχος των φύλλων έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα με μέγιστο τα 4 αναγεννημένα φυτά ανά έκφυτο. Ο συνδυασμός αυτών των μεθόδων αποτελεί έναν άριστο τρόπο πολλαπλασιασμού της βερικοκιάς «Μπεμπέκου», απόκτησης μεγάλου αριθμού φυτών ομοιόμορφης γενετικής σύστασης και απαλλαγμένων από προσβολές.